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CASA精子浓度精确测定原理

精子浓度(Sperm concentration)的定义是:每单位体积(ml)精液中精子的数目。

精子浓度测定原理:假设精液充分混匀后每单位体积中的精子数目相同。那么在10um深度的玻片中(精子是单层的),一个显微视野(面积为A um2)下的精子数目N(个)是可?#21248;?#24037;或计算机数出来的。

那么计算精子浓度C的公式为:C=100N/A(10^6/ml)。

测量精子浓度时有2个方面特别重要:

A、确保精液充分混匀;这方面主要由实验室控制,

B、确保测量单个显微视野面积A的准确性,该方面由CASA测定,每台CASA的A值?#21152;?#35813;单独测定。

我们以测定CASA摄像机在显微镜下的单个视野面积为例介绍一下精确测量方法。

小知识:摄像机记录的显微视野的面积(A)通常由以下几个方面决定:

1、物?#24403;?#25968;:物?#24403;?#25968;越大那么能看到的显微镜下的视野面积就越小;测量浓度我们采用的是10x相差物镜;

2、摄像机靶面大小:摄像机的靶面面积越大,所能拍摄的视野面积就越大;例如:我们采用的Basler sca780-54fc/gc的靶面大小为1/2寸。

3、转接口(连?#30001;?#20687;机与显微镜):转接口的倍数越大,所能显示的视野越小;通常由0.5x,0.75x,1x,我们采用的转接口的倍数为1x(1倍)。

通过这三个方面查询硬件的相关参数可以直接计算单个显微视野的面积大小,?#27492;?#31934;确,但是我们不能这么做!

原因就是:任何物理设备所标定的值都不是绝对准确的,这三个物理设备的标称值都可能有偏差,譬如物?#24403;?#25968;10倍,但?#23548;?#19978;,它可能是10.1倍,10.2倍,9.8倍,而精液浓度计算时,也许就是几微米的差别也能使浓度差上数百万个/ml。

我们需要选择的方法是直接测量法:

正确方法:

在显微镜下放上测微尺,通过测微尺和测距软件测量视野的?#23548;?#38271;度和宽度从而计算视野的面积A大小。

原理:测微尺上的每个刻度的长度是一定的假设单位长度为D,那么当截取了显微镜视野的照片后,可以用专用软件测量出图像在软件?#22411;?#20687;长度L,宽度W,重复测量3个单位刻度(确保准确)在软件中的长度分别为D1,D2,D3,那么显微镜视野的真实长度Lr=(3×L×D)/(D1+D2+D3)(公式变形)Wr==(3×W×D)/(D1+D2+D3),

那么显微视野面积A=Lr×Wr

步骤:

1、将显微镜测微尺放在载物台上,调节焦距至最清晰;

2、将测微尺靠边垂?#20493;?#20013;,并拍摄显微视野照片;

3、将该图片导入测距软件中;

以本图为例:



以穗加CASA为例,采用Ph10x相差物镜,Basler scA780-54fc摄像机,1x转接口,

本测微尺的单位刻度长度为D=0.01mm(10um),图上测量:L=206.35,W=153.44,D1=3.1785,D2=3.1822,D3=3.1868

则:Lr=648.29(um),Wr=482.06(um),

面积A=312515.29(um2)

用测距软件的优势是:排除目测法的主观性,精确测量每一个长度。

CASA对摄像机要求

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CASA测定精子浓度

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